AW-12全自動(dòng)清洗工作站使用報(bào)告（1）

AW系列全自動(dòng)工作站是根據(jù)Western Blot實(shí)驗(yàn)需要，通過(guò)儀器代替繁瑣、重復(fù)、枯燥的人工試驗(yàn)。AW-12是捷美自主研發(fā)的一款全自動(dòng)化的Western Blot操作系統(tǒng)，自動(dòng)化實(shí)現(xiàn)制冷低溫儲(chǔ)存、封閉、孵育、洗膜、回收一抗和二抗的整套流程。數(shù)控操作流程可避免手工的操作誤差，降低背景，提高信噪比和相對(duì)靈敏度，確保同批次和不同批次間實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性。

1 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?

AW-12全自動(dòng)清洗工作站應(yīng)用，進(jìn)行手工和儀器處理的效果對(duì)比，驗(yàn)證儀器使用的可靠性。

2 實(shí)驗(yàn)原理

蛋白質(zhì)印跡法（免疫印跡試驗(yàn)）即Western Blot。它是分子生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫遺傳學(xué)中常用的一種實(shí)驗(yàn)方法。其基本原理是通過(guò)特異性抗體對(duì)凝膠電泳處理過(guò)的細(xì)胞或生物組織樣品進(jìn)行著色。通過(guò)分析著色的位置和著色深度獲得特定蛋白質(zhì)在所分析的細(xì)胞或組織中表達(dá)情況的信息。

3 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

3.1 實(shí)驗(yàn)試劑

3.2 實(shí)驗(yàn)儀器

3.3 樣品制備

3.3.1 細(xì)胞準(zhǔn)備（293T細(xì)胞為例）

3.3.1.1 細(xì)胞復(fù)蘇

將凍存的細(xì)胞從液氮中取出，并立即放入37℃水浴中，左右晃動(dòng)凍存管直至管內(nèi)液體全部融解。然后將液體加入裝有 9mL 培養(yǎng)基的離心管中，立即混勻。離心4℃，300×g，5min。棄去上清，細(xì)胞沉淀用10% FBS、5ml 雙抗（青霉素10000U/ml，鏈霉素10000U/mL）的DMEM高糖完全培養(yǎng)基懸浮后轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶中，最后將細(xì)胞培養(yǎng)瓶放進(jìn)37℃，5% CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

3.3.1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

293T細(xì)胞DMEM高糖完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37℃，5% CO2 飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)，當(dāng)293T細(xì)胞生長(zhǎng)至培養(yǎng)皿底部90%左右時(shí)傳代，用含有0.25%胰酶的細(xì)胞消化液消化，消化一段時(shí)間后用含有血清的完全培養(yǎng)基終止，傳代或鋪板。待細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

3.3.2 蛋白裂解

（1）從細(xì)胞房CO2培養(yǎng)箱中取出細(xì)胞拿回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行操作。

（2）用移液器吸取細(xì)胞培養(yǎng)皿中的細(xì)胞培養(yǎng)液棄去，每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)皿中加入預(yù)冷的PBS 清洗一遍，棄去PBS。（一定要吸凈，否則會(huì)影響蛋白的濃度)。加入適量的細(xì)胞裂解液進(jìn)行裂解（10cm 細(xì)胞培養(yǎng)皿中大約加500μl），輕輕搖晃均勻。

（3）冰上裂解20分鐘。

（4）裂解后的細(xì)胞小心的用移液槍吹打，盡量不要吹出氣泡。吸取液體，置于預(yù)先標(biāo)記好的EP管中，在冷凍離心機(jī)中12000×g離心15分鐘（全部操作都要在冰上進(jìn)行，冷凍離心機(jī)要提前預(yù)冷)。

（5）吸取離心后的上清液轉(zhuǎn)移至預(yù)先標(biāo)記好的新的EP管中，注意不要吸到沉淀，可以用冷凍離心機(jī)瞬離，保證沒(méi)有氣泡。進(jìn)行下一步處理或保存于-80℃冰箱。

3.3.3 煮樣

利用BCA試劑盒測(cè)蛋白樣品的濃度，并將其總蛋白濃度制成3mg/ml，加5×loading buffer振蕩混勻后，置于100℃金屬浴中10min，蛋白變性，制好的蛋白樣待上樣或保存在-20℃。

（發(fā)布于：2021-04-29）