AW-12全自動(dòng)清洗工作站使用報(bào)告（2）

1 實(shí)驗(yàn)背景

蛋白質(zhì)印跡法（免疫印跡試驗(yàn)）即Western Blot。是分子生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫遺傳學(xué)等眾多學(xué)科領(lǐng)域中常用的一種檢測(cè)特異蛋白質(zhì)表達(dá)水平的實(shí)驗(yàn)方法，傳統(tǒng)手工方法操作時(shí)間久，結(jié)果穩(wěn)定性差，為了解決這些問(wèn)題，捷美自主研發(fā)了一款A(yù)W-12全自動(dòng)清洗工作站，代替繁瑣、重復(fù)、枯燥的手工實(shí)驗(yàn)過(guò)程，自動(dòng)化實(shí)現(xiàn)制冷低溫儲(chǔ)存、封閉、孵育、洗膜、回收一抗和二抗的整套Western blot孵育流程。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，AW-12的顯影效果完全可以達(dá)到傳統(tǒng)手工得到的效果，而且比傳統(tǒng)手工結(jié)果更穩(wěn)定。

2 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?

比較AW-12全自動(dòng)清洗工作站和傳統(tǒng)手工方法操作Western blot實(shí)驗(yàn)得出的顯影效果，驗(yàn)證儀器使用的可靠性及穩(wěn)定性。

3 Western Blot

3.1 制膠

3.1.1 準(zhǔn)備

先用試管刷蘸取洗潔精洗去玻璃板上污漬，用自來(lái)水將板上殘留的洗潔精沖洗干凈，再用蒸餾水沖洗；先將棉墊墊于配膠板上，玻璃板對(duì)齊后放入夾中卡緊，然后垂直卡在架子上，然后向其中加滿(mǎn)ddH2O靜置5min，不漏，倒掉ddH2O,傾斜制膠板晾干。

3.1.2 分離膠

按照表1配制8%分離膠，振蕩混勻后用1ml槍沿兩塊玻璃板間的一角緩慢加入下層膠，槍內(nèi)膠不要一次性全部加完，注意不能有氣泡，加至綠框下緣平行。最后在板內(nèi)加入無(wú)水乙醇，液封。室溫下等待30min，待下層膠完全凝固后，倒掉上面的無(wú)水乙醇，傾斜制膠板晾干。

3.1.3 濃縮膠

準(zhǔn)備好梳子，按照表1配制濃縮膠振蕩混勻后用移液槍加至玻璃板上緣，注意不能產(chǎn)生氣泡。隨從一側(cè)緩慢插入梳子，室溫下等待30分鐘，待上層膠完全凝固。

3.2 點(diǎn)樣和電泳

3.2.1

取下配好的膠置于電泳槽內(nèi)，從槽中間加入電泳緩沖液，中間倒?jié)M沒(méi)過(guò)梳子，外面至相應(yīng)刻度線(xiàn)即可。平行拔出梳子，用200ul移液槍吹孔，以保證孔內(nèi)通暢。按照Marker 加2.5ul/孔，蛋白樣品加10ul/孔。

3.2.2

蓋上電泳槽蓋子（注意正負(fù)極），電泳起始電壓為70V，待其進(jìn)入到分離膠后調(diào)整電壓至90V跑至底部結(jié)束。

3.3 轉(zhuǎn)膜

3.3.1

在SDS-PAGE即將完成時(shí)，制備轉(zhuǎn)膜液，準(zhǔn)備好冰塊，先將轉(zhuǎn)膜液預(yù)制冷，剪取于凝膠大小相當(dāng)?shù)腜VDF膜一張及四張濾紙，PVDF膜于甲醇中浸泡2min左右轉(zhuǎn)移至轉(zhuǎn)膜液中。濾紙及海綿浸泡于轉(zhuǎn)膜液中備用。

3.3.2

按照下面的順序?qū)⒛づc濾紙放置在轉(zhuǎn)移裝置上：負(fù)極→黑色海綿→2張濾紙→凝膠→PVDF膜→2張濾

3.4 封閉和抗體孵育

3.4.1 傳統(tǒng)手工方法

3.4.1.1

封閉：準(zhǔn)備（貯備）好一個(gè)干凈的孵育盒，轉(zhuǎn)膜完成后，將PVDF膜完全置于封閉液中（含5%脫脂牛奶的PBST），然后將孵育盒放置于水平脫色搖床上，轉(zhuǎn)速60，室溫封閉1h。

3.4.1.2

洗膜：用PBST（含1%的Tween-20）洗膜，轉(zhuǎn)速110，3次，5min/次。

3.4.1.3

一抗孵育：將PVDF膜根據(jù)所要目的條帶進(jìn)行剪裁，然后將其加入稀釋了適當(dāng)濃度的一抗（用2%BSA稀釋1:1000）中，放置在水平脫色搖床上，轉(zhuǎn)速60，將搖床放進(jìn)4oC冷庫(kù)中孵育過(guò)夜。

3.4.1.4

洗膜：用PBST洗膜，轉(zhuǎn)速110，3次，10min/次。

3.4.1.5

二抗孵育：加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠和羊抗兔的二抗（5%脫脂牛奶稀釋比例1：5000），置于水平脫色搖床上，轉(zhuǎn)速60，室溫反應(yīng)1h。

3.4.1.6

洗膜：用PBST洗膜，轉(zhuǎn)速110，3次，10min/次。

3.4.1.7

最后向孵育盒中加入PBST，將孵育盒放入4℃冰箱中，等待顯影。

3.4.2 AW-12全自動(dòng)清洗工作站的方法

3.4.2.1

準(zhǔn)備：

① 提前根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求準(zhǔn)備好一抗、二抗試管，以及孵育盒，打開(kāi)儀器開(kāi)關(guān)，預(yù)制冷。

②根據(jù)所選擇孵育盒的規(guī)格準(zhǔn)備抗體的量（參見(jiàn)表2），然后將一抗二抗抗體加入對(duì)應(yīng)抗體管中，并將抗體管放進(jìn)對(duì)應(yīng)的抗體儲(chǔ)存位置，孵育盒放進(jìn)孵育槽中，手動(dòng)向孵育盒中加入5%脫脂牛奶（加液量參見(jiàn)表2）。

③準(zhǔn)備足量ddH2O（洗針液）和PBST（清洗液）于相對(duì)應(yīng)的桶中，及時(shí)倒掉廢液桶中的廢液，以免廢液溢出。

3.4.2.2

剪膜：轉(zhuǎn)膜完成后，將PVDF膜根據(jù)所要的目的條帶進(jìn)行剪裁，并將其放入對(duì)應(yīng)的孵育盒中，蓋上孵育盒蓋子。

3.4.2.3

程序設(shè)置：

根據(jù)孵育盒的選擇及所選擇的通道（1-12），在顯示屏上點(diǎn)擊選擇對(duì)應(yīng)的通道和孵育盒的規(guī)格，儀器根據(jù)所選的孵育盒規(guī)格提供了默認(rèn)參數(shù)（參見(jiàn)表2），如有需求可以更改參數(shù)。程序設(shè)置完成后，點(diǎn)擊屏幕上的“運(yùn)行”，程序開(kāi)始運(yùn)行。

3.4.2.4

管路清洗：

程序運(yùn)行結(jié)束后，孵育盒始終保持低溫狀態(tài)，手動(dòng)取出抗體管回收抗體，然后進(jìn)入管路清洗頁(yè)面點(diǎn)擊“管路清洗”，開(kāi)始清洗管路。

3.4.2.5

后續(xù)直接顯影就可關(guān)機(jī)并把膜取出，若暫時(shí)不顯影可在運(yùn)行結(jié)束后，讓儀器始終保持此狀態(tài)，孵育盒及抗體儲(chǔ)存位置始終保持低溫狀態(tài)。

3.5 顯影

將膜取出，置于暗盒中，將適量的ECL發(fā)光液（1：1混勻后）均勻地加到膜上，進(jìn)行膠片曝光。壓片，并用顯影液和定影液進(jìn)行手工洗片，待膠片風(fēng)干后掃描記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

從上面顯影結(jié)果可以明顯看出，應(yīng)用AW-12全自動(dòng)清洗工作站可以獲得清晰、低背景的結(jié)果，其效果完全可以達(dá)到或優(yōu)于傳統(tǒng)手工得到的效果，并且儀器可以節(jié)省手工操作所花費(fèi)的時(shí)間。

5 客戶(hù)試用提供顯影結(jié)果圖

（發(fā)布于：2021-05-20）