AW系列全自動清洗工作站技術特點介紹（一）

Western blot 是對目的蛋白進行檢測的一種實驗方法，大致分為：蛋白提取、蛋白定量、SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、抗原-抗體免疫反應（一抗孵育、二抗孵育）、蛋白檢測。具體的步驟和原理前面已有介紹，本次的主題主要針對AW系列產(chǎn)品的技術特點進行詳細介紹，主要分為溫控、高通量、高回收率三大技術特點。結(jié)合儀器技術特點便于大家對本產(chǎn)品的應用有更深入的了解，這一期我們先介紹AW-12產(chǎn)品的溫控技術特點在Western blot實驗中的具體應用。

溫控技術特點在Western blot實驗步驟中的重要性主要體現(xiàn)在抗原-抗體免疫反應和顯影前的膜片浸泡（貯存）兩方面。

一 抗原-抗體免疫反應

也就是western blot實驗步驟中的一抗孵育和二抗孵育。在這個步驟中抗體的選擇、抗體的稀釋比例、抗體的孵育時間以及溫度對實驗的結(jié)果都是十分的重要，每一個環(huán)節(jié)都不能出問題，否則都會嚴重影響實驗結(jié)果，導致實驗失敗。

抗原-抗體免疫反應示意圖

一抗孵育

一般我們會首選與目的蛋白特異性結(jié)合的單克隆抗體（即單抗），之前大多都傾向于選擇國外的一些品牌，近來國產(chǎn)抗體也相繼出現(xiàn)一些優(yōu)秀的品牌可供選擇。然而對于沒有單抗的抗體則會選擇有實驗驗證或有文獻作為參考的多克隆抗體（即多抗）。一抗與目的蛋白表面的抗原表位結(jié)合，而膜表面的非特異性位點因為被封閉過程中牛奶的蛋白質(zhì)所結(jié)合，因此與一抗的結(jié)合量很少，結(jié)合的抗體也會在一抗清洗時被去除。一抗孵育的溫度和時間，最常用的有兩種條件：1）4℃搖床過夜孵育，溫度適宜，分子運動溫和，一抗與目標蛋白結(jié)合充分；而且低溫（4℃）條件下也可以提高抗體的回收利用率，節(jié)約實驗成本。2）37℃搖床孵育1-2h，但溫度越高，分子間的運動能力增強，出現(xiàn)非特異性結(jié)合的可能性就越高；同時孵育時間較短，也可能會導致一抗與目標蛋白結(jié)合不充分。但對于一些非常好用的抗體，這個孵育條件也是可以的，但是不利于抗體的回收利用，室溫條件會大大降低抗體的活性，影響抗體的重復利用。

然而無論實驗人員選擇哪一種一抗孵育的時間和條件，AW-12都可以滿足要求，AW-12具備了低溫貯存、低溫和室溫孵育功能，低溫貯存功能可以使貯存的抗體在實驗過程中始終保持在低溫狀態(tài)，有利于維持抗體的活性；低溫和室溫孵育功能可根據(jù)實驗人員的具體實驗需求進行選擇，時間和抗體是否回收也可根據(jù)需求自行設置，操作簡單且十分人性化，完全滿足實驗人員對抗體孵育的各種要求。

二抗孵育

一抗結(jié)合之后，就是選擇與一抗結(jié)合的二抗，而二抗蛋白結(jié)構被HRP（辣根過氧化物酶）標記，可與發(fā)光底物相結(jié)合，該底物極強的信號輸出使得目的蛋白被檢測到，因此得到顯影結(jié)果。二抗孵育的一般條件是室溫1h，為了防止二抗孵育和清洗時間過久導致HRP信號減弱，因此可以選擇在低溫條件下清洗二抗，AW-12只需要在二抗清洗步驟中將溫度設為低溫即可，也可選擇在室溫條件下清洗，根據(jù)實驗需求進行選擇即可。

二 膜片浸泡（貯存）

抗原-抗體免疫反應完成后，如果不及時進行顯色曝光，就需要將膜片浸泡在清洗液（PBST/TBST）中并保存在低溫環(huán)境中，保持膜片上的抗體活性和二抗上HRP的信號。如果是手工操作實驗，最后膜片浸泡時需要將膜片孵育盒放到4℃冰箱中保存，等待實驗人員顯色曝光；而使用AW-12進行實驗時，我們儀器默認的程序設置是在膜片浸泡時始終保持在低溫狀態(tài)，直到實驗人員將膜片拿出顯色曝光。

抗原-抗體免疫反應步驟手工與AW-12對比圖

從上述對比圖也可以明顯看出使用AW-12來完成抗原-抗體免疫反應至顯色曝光這一段實驗流程，不僅可以大大節(jié)約實驗人員的時間，AW-12的低溫貯存功能和低溫、室溫孵育功能更能靈活的滿足實驗的各種需求。

（發(fā)布于：2021-08-26）