Western blot常見問題分析（下）
Western blot（WB）是實驗室中常見且重要的一種分子生物學(xué)實驗方法
具體的實驗原理和實驗步驟在前幾期中已經(jīng)做了詳細的介紹，實驗步驟大致分為：蛋白提取、蛋白定量、SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育、清洗、二抗孵育、清洗、蛋白檢測。步驟復(fù)雜，耗時長，容易出現(xiàn)各種問題，尤其對于新手來說更是一個挑戰(zhàn)。為了讓大家能夠?qū)⑦@個實驗做到完美，本期就簡單向大家總結(jié)歸納了WB實驗中常見的一些問題，并給出了解決方案，目的是為了讓大家了解WB實驗中的注意點和規(guī)范操作的必要性，同時也是方便大家在出現(xiàn)問題后能夠及時分析出原因，調(diào)整實驗方案，得到預(yù)期結(jié)果。
我們將常見問題總結(jié)歸納為背景高、條帶形狀異常、非特異性條帶、沒有條帶或條帶弱4大類。
本期我們接著介紹非特異性條帶、沒有條帶或條帶弱這兩種常見問題。
一、非特異性條帶
| 原因分析 | 建議解決方案 |
| 一抗?jié)舛冗^高 | 降低一抗稀釋濃度，減少非特異性條帶 |
| 一抗特異性不高 | 可更換抗體 |
| 蛋白樣本降解 | 提取蛋白時可加蛋白酶抑制劑，全程冰上操作 |
| 目的蛋白可能存在多個剪切體 | 查閱說明書和文獻進行參考 |
| 一抗不純，被其他抗體污染 | 重新配制新的一抗溶液 |
二、沒有條帶或條帶弱
| 原因分析 | 建議解決方案 |
| 一抗/二抗?jié)舛鹊停瑫r間短 | 增加抗體濃度，延長孵育時間 |
| 一抗/二抗不匹配 | 確定抗體的種屬性 |
| 蛋白樣本濃度低 | 增加樣本的上樣量 |
| 蛋白降解 | 重新制備樣品，增加陽性樣本對照 |
| 轉(zhuǎn)膜不充分，或轉(zhuǎn)時間久了 | 轉(zhuǎn)膜后染色看轉(zhuǎn)膜的效果，控制轉(zhuǎn)膜的時間和電流 |
| 轉(zhuǎn)膜正負極反了 | 轉(zhuǎn)膜時認真檢查裝置和轉(zhuǎn)膜夾放置的方向 |
| 過度洗膜 | 要控制洗膜時間，不宜過長 |
| 過度封閉 | 減少封閉時間，或更換封閉液 |
| 二抗標(biāo)記的HRP失效 | 檢查是否使用含疊氮化鈉的試劑或容器 |
從上面的問題分析可以看出在實驗過程中會出現(xiàn)很多人為操作上的失誤，比如封閉時間、清洗時間、抗體孵育時間的控制；抗體孵育的溫度條件；保持膜的濕潤等。為了避免這些人為操作所導(dǎo)致實驗失敗的因素，可以通過使用我司研發(fā)的一款A(yù)W系列全自動清洗工作站，從封閉到顯色之前都可以在這臺設(shè)備中完成，即可以控制時間和溫度，也大大節(jié)約了人為參與的時間，降低人為誤差，提高實驗成功率。
（發(fā)布于：2022-04-20）