細(xì)胞培養(yǎng)——細(xì)胞凍存

細(xì)胞培養(yǎng)在實(shí)驗(yàn)完成后需要將細(xì)胞凍存存放起來，以便以后實(shí)驗(yàn)需要，可以將凍存的細(xì)胞直接復(fù)蘇使用。然而為了使復(fù)蘇得到的細(xì)胞狀態(tài)好，可直接用于實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞在凍存時(shí)的狀態(tài)就顯得尤為重要，一定要選擇細(xì)胞培養(yǎng)狀態(tài)好的時(shí)候?qū)⒓?xì)胞凍存起來，其次是凍存細(xì)胞的方式和條件，凍存液的選擇等對細(xì)胞凍存都很重要。

下面簡單介紹一下細(xì)胞凍存方面的知識

一、什么是細(xì)胞凍存？

細(xì)胞放在低溫環(huán)境，減少細(xì)胞代謝，以便長期儲存。

二、細(xì)胞凍存的具體操作步驟

1、配制含10%DMSO、90%胎牛血清的凍存液或市面上購買的凍存液。

2、從培養(yǎng)箱取出細(xì)胞培養(yǎng)瓶（一般選擇處于對數(shù)期的細(xì)胞），轉(zhuǎn)移到超凈臺。棄去原有培養(yǎng)液，用1-2mL PBS緩沖液洗滌1次（注意從側(cè)壁加入，以免沖掉細(xì)胞），棄去PBS緩沖液。

3、向培養(yǎng)瓶中加入1mL胰酶，消化，將加入胰酶的細(xì)胞培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移到倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，當(dāng)細(xì)胞變圓且大量脫落時(shí)，轉(zhuǎn)移到超凈臺。

4、加入2mL完全培養(yǎng)基，終止消化。用移液器充分緩慢吹打，使細(xì)胞能夠完全脫落。然后將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至15mL離心管中，1000rpm/min離心5分鐘，轉(zhuǎn)移進(jìn)超凈臺，打開蓋子，棄去上清。

5、加入適量凍存液，用移液器輕輕吹打細(xì)胞團(tuán)塊，制備成細(xì)胞懸液，調(diào)節(jié)凍存液中細(xì)胞密度，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)按照T25培養(yǎng)瓶一瓶凍存2-3管，將細(xì)胞分裝入凍存管中，每管1-1.5 ml。

6、在凍存管上標(biāo)明細(xì)胞的名稱，凍存時(shí)間及操作者。

7、將裝有細(xì)胞的凍存管放入4℃冰箱30min，后-20℃冰箱30min，然后放入-80℃冰箱中過夜，取出凍存管，移入液氮容器內(nèi)?；虬凑諆龃嬉赫f明書操作。

注意事項(xiàng)

1.使用DMSO前，不需要進(jìn)行高壓滅菌，它本身就有滅菌的作用。高壓滅菌反而會破壞它的分子結(jié)構(gòu)，以至于降低冷凍保護(hù)效果。在常溫下，DMSO對人體有害，故在配制時(shí)最好戴上手套操作。

2.細(xì)胞凍存注意要慢凍，按照溫度梯度降溫法進(jìn)行，不宜將凍存細(xì)胞放置在0℃～-60℃這一溫度范圍內(nèi)過久，低溫?fù)p傷主要發(fā)生在這一溫度區(qū)內(nèi)，是“危險(xiǎn)溫區(qū)”，實(shí)驗(yàn)操作中可將細(xì)胞凍存管裝在程序降溫盒中再放入-80℃冰箱，使之以約1℃/min的降溫速度渡過“危險(xiǎn)溫區(qū)”后保留在低溫冰箱或轉(zhuǎn)移至液氮罐。

3.注意定期檢查液氮罐內(nèi)液氮量，及時(shí)添加。

（發(fā)布于：2022-06-26）